目前，cf⁃DNA产前筛查已广泛应用于胎儿21、18、13号染色体非整倍体检测，但对于SCA检测却依然在不断的探索中。在我国，2013年1项对于cf⁃DNA产前筛查的研究表明，cf⁃DNA产前筛查对于SCA的检出率仅为50%。
cf⁃DNA产前筛查影响SCA检测效率的因素
导致SCA检出率及准确率降低的原因是多方面的。（1）测序因素：X染色体的GC碱基的含量较高，会导致测序错误率增高；且X和Y染色体具有一定的同源序列，为序列比对造成一定困难。（2）胎盘及胎儿因素：由于胎源性cf⁃DNA片段被认为来自胎盘合体滋养细胞，故限制性胎盘嵌合、胎盘-胎儿染色体核型不一致、真性胎儿嵌合等，也会对cf⁃DNA产前筛查的结果造成一定的影响。（3）孕妇因素：孕妇和胎盘都会产生cf⁃DNA，孕妇外周血循环中大部分为母源性cf⁃DNA，多来自孕妇的造血细胞，而胎源性cf⁃DNA 仅占比4%20%，故孕妇染色体数目异常或母源性CNV必然会对cf⁃DNA产前筛查的结果造成一定的影响。反之，cf⁃DNA产前筛查可能意外检测出孕妇本身的性染色体数目异常或CNV。本研究在74例SCA假阳性cf⁃DNA产前筛查孕妇中，通过孕妇白细胞的CNV-seq检测发现其中19例是由于孕妇X染色体数目异常或母源性CNV导致，占SCA假阳性者的比例高达25.7%，占所有SCA高风险者的15.3%，提示孕妇X 染色体数目异常或母源性CNV 可能是cf⁃DNA产前筛查对于胎儿SCA的检出率及准确性最重要的影响因素。
人群中孕妇性染色体异常的携带情况
据报道，孕妇SCA或携带嵌合型SCA的发生率约为1/400，其中常见的异常类型为45，X/46，XX嵌合和47，XXX。
已知45，X会导致女性Turner综合征，完全型Turner综合征女性患者临床多表现为身材矮小、颈蹼、原发性闭经及生育能力异常等；但45，X/46，XX嵌合型Turner综合征女性患者的临床表型却随着嵌合比例的不同而表现出大的差异。2019年的1项研究对于244 848例女性进行单核苷酸多态性微阵列分析（SNP array），研究其X染色体异常与表型的关系，结果显示，部分45，X/46，XX嵌合的女性可有正常的表型及生育能力，可顺利成活并生育后代。但在进行cf⁃DNA产前筛查时，该嵌合可能导致染色体X-或X-（Y）高风险。除了孕妇本身为嵌合型Turner综合征患者外，X染色体丢失也可造成孕妇外周血染色体核型45，X/46，XX嵌合［19］。2006年，英国索尔兹伯里区医院对655例从出生至80岁的女性进行了细胞遗传学分析，研究发现，染色体核型正常的女性随着年龄增加，会经历渐进的和选择性的X染色体丢失现象，从而导致外周血染色体核型由46，XX转变为45，X/46，XX嵌合。该研究中，<16岁年龄段的女性X 染色体的丢失率为0.07%；而在>65年龄段的女性中，X染色体的丢失率高达7.3%（P<0.01）。基于该项研究，随着孕妇年龄的增加，其外周血中出现45，X细胞的可能性增高，其释放的异常母源性cf⁃DNA增加，可能导致cf⁃DNA产前筛查提示染色体X-或X-（Y）高风险。本研究中，共检出孕妇45，X/46，XX嵌合11例，其中5例为低龄孕妇，6例为高龄（≥35岁）孕妇，可能受样本量限制，未能体现出和孕妇年龄的相关性。
已知47，XXX会导致女性超雌综合征，该疾病的发生率约为45/100 000，多数患者无明显临床异常，表现仅为身材较为高大，受累女性的智商在正常范围内；部分患者有轻度的学习障碍，主要表现为词汇障碍；可以有正常的生育能力，故多数患者未明确诊断。理论上，47，XXX患者的后代50%是正常的、50%为47，XXX或47，XXY患者，但实际上并非如此，除了有少量关于47，XXX孕妇分娩性染色体异常和常染色体非整倍体后代的病例报道，研究显示，多数47，XXX患者后代的细胞遗传学是正常的。据报道，高达90%的47，XXX的女性患者可能并未意识到自己的染色体异常。但是在cf⁃DNA产前筛查中，孕妇47，XXX则会影响检测结果，导致cf⁃DNA产前筛查提示染色体X+或X+（Y）高风险。本研究中，共检出孕妇47，XXX 7例，孕妇本身均无明显异常的临床症状。
另外，研究表明，在表型正常的个体中，相对于常染色体，X染色体携带CNV的频率更高。2004年，Sebat 等对39 例无亲缘关系的正常个体进行CNV检测，共发现255条CNV，并绘制出正常个体中发现的CNV在人类基因组上的分布图，发现X染色体携带CNV的频率远高于常染色体。由于女性个体受X染色体失活效应的影响，相比于常染色体，对X染色体携带的CNV的包容性更高，故正常人群中X染色体上CNV的携带频率也相对较高。若表型正常孕妇的X染色体携带CNV，同样会导致在对cf⁃DNA产前筛查结果分析时发现来自X染色体的DNA测序片段增多或减少，从而得出SCA假阳性或假阴性的结果。本研究中，检出孕妇X染色体携带CNV 1例，孕妇本身无明显异常的临床症状。
孕妇白细胞CNV-seq检测的优势
本研究提示，对孕妇进行染色体核型及CNV检测可能有助于提高cf⁃DNA 产前筛查对于胎儿SCA的准确率，因此，需1种方便、快捷且有效的方法来进行检测。目前，常见的方法包括孕妇外周血细胞培养进行染色体核型分析、芯片及荧光原位杂交技术（FISH）检测等。而本研究选用孕妇外周血白细胞进行CNV⁃seq，相比于其他方法具有以下优势：
（1）孕妇无需额外采血：孕妇采集的外周血离心后，上层血浆部分被用于cf⁃DNA产前筛查，中间的白细胞层包含了大量的孕妇白细胞，可直接留取备用，无需额外采集；
（2）免去细胞培养环节，可省去等待细胞生长的时间，既降低了培养失败导致无法出具结果的可能，也缩短了检测周期，同时避免了受体外培养优势生长效应而造成的嵌合比例变化和假性嵌合；
（3）作为1种高通量分子检测手段，可有效降低人工错误率，如计数错误、染色体核型选择偏差、染色体带纹分辨不清等；
（4）不受探针位置限制，可同时检测所有染色体剂量的变化；
（5）成本相对较为低廉。基于以上优势，本研究选择采用孕妇外周血白细胞CNV⁃seq来探寻孕妇性染色体异常对cf⁃DNA产前筛查结果的影响。
对于胎儿SCA检测的挑战
本研究提示，对孕妇进行染色体核型及CNV检测可降低cf⁃DNA产前筛查对于胎儿SCA的假阳性或假阴性报告，从而提升cf⁃DNA产前筛查对于胎儿SCA检测的敏感度及特异度。然而，对于胎儿SCA检测的挑战依然存在，例如，在取得胎儿SCA高风险结果之后，即使确诊了孕妇X染色体存在异常，依然无法直接判断胎儿性染色体是否正常，仍需要进行侵入性产前诊断。同时，漏诊的1种可能性是，若孕妇的染色体嵌合与胎儿染色体异常刚好相补，则cf⁃DNA产前筛查将会存在假阴性的可能，如在极端的情况下，若孕妇的染色体核型为45，X（10%）/46，XX（90%），胎儿的染色体核型为47，XXX，且胎源性cf⁃DNA的含量刚好为10%，则cf⁃DNA产前筛查的结果可能为低风险。提示，如cf⁃DNA产前筛查的结果为阴性，而已知孕妇为性染色体携带异常，则应提高警惕，立即对胎儿进行产前诊断，以降低假阴性率。
本研究的局限性在于，对于孕妇SCA的检测并不能完全解释所有cf⁃DNA产前筛查假阳性及假阴性的原因，因为胎盘嵌合等因素也同样影响着cf⁃DNA产前筛查的效率。同时，对于孕妇SCA的检测可能会在一定程度上增加孕妇及家属不必要的焦虑，应在签署知情同意书及遗传咨询时进行充分沟通。
综上所述，本研究提示，当cf⁃DNA产前筛查应用于对胎儿SCA的检测时，遗传咨询时应重点强调该结果可能受孕妇X染色体异常的影响。当产前诊断和cf⁃DNA产前筛查结果不一致时，推荐进行孕妇白细胞CNV⁃seq，以明确假阳性或假阴性的原因。对于已明确X染色体异常或携带CNV的孕妇，则不推荐进行cf⁃DNA产前筛查。
