近年，基因组测序技术在临床中的应用价值逐渐得到肯定，国内已有机构将其拓展至产前诊断领域进行应用。然而，如何合理有效地应用这一新技术，如何构建基因组测序技术在产前诊断中应用的体系，尚处于摸索阶段。2018年，考虑到基因组测序技术用于临床的复杂性，国际产前诊断学会（International Society of Prenatal Diagnosis，ISPD）、母胎医学会（Society for Maternal Fetal Medicine，SMFM）和围产期质量基金会（Perinatal Quality Foundation，PQF）共同发表联合立场声明，旨在为相关从业者和实验室人员提供应用本技术时“应注意的问题”。现将声明作一解读，以助于国内相关从业者参考。全外显子组测序（whole exome sequencing，WES）、panel测序（即针对一类或几类疾病的基因靶向测序）和全基因组测序（whole genome sequencing，WGS），以下合并简称为测序。
一、背景
人群中约有1%会受到单基因病的影响。单基因病是胎儿发育异常、死胎、围产期和幼儿期死亡及远期致病的主要原因之一。然而，随着治疗方法的进步，胎儿宫内治疗或早期新生儿治疗成为可能，可减轻或预防许多疾病的不良后果。因此，对单基因病进行产前诊断，可帮助医患双方了解病情，决定是否继续妊娠，评估再次妊娠的风险。
过去几年的实践证明，对怀疑有遗传病但染色体微阵列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）结果正常的个体进行WES，可增加25%30% 的异常检出率。现在，DNA测序已经迅速成为诊断遗传病的重要工具。目前，常用的是panel 测序和WES，但随着基因变异注释工具（如ClinVar、Proven、SIFT等）的丰富、数据可靠性的增加及成本的降低，WGS也越来越多地被应用。
测序是用于评估产前超声发现结构异常胎儿的遗传病因的新兴技术。该新技术的应用，在提高检出率的同时，对医患双方的教育提出了更高的要求，同时也带来了一些重大的挑战，包括父母和（或）胎儿的偶然发现，对家庭成员的影响，以及对结果进行再分析的责任。联合声明参考了现有几乎所有的文献，包括荟萃分析、队列分析、政策指南评审和专家意见，同时也参考了第21届ISPD产前诊断和胎儿治疗年会上小组讨论的要素和评论。
二、总则
（一）声明内容
当常规遗传学检测（如CMA技术）结果正常，或根据现有的临床指南进行的检测均为阴性时，或根据专家意见行常规遗传学检测获得阳性结果的可能性小于测序时，可使用测序对胎儿进行评估。
由于验证数据不足以及对其利弊的认识不足，暂不推荐测序常规用于产前诊断。当具有足够样本量的前瞻性研究完成后，此意见可能会进行修改。目前，测序在产前诊断中的应用最好限于研究。如果用于研究以外，则须通过多学科会诊认为某病例通过测序可更快、更准确地得到阳性结果，在遗传学专家的指导下，由有临床应用测序技术经验的人员及精通产前影像学和咨询的专家共同处理。
（二）解读
以上为测序在产前诊断中应用的总体原则说明，强调了目前测序在产前诊断中应用的指征、性能等尚缺乏循证医学的依据。因此，如在科研以外应用测序技术对胎儿进行检测，需要建立多学科讨论机制，多学科成员应包括临床遗传学专家、有应用测序技术经验的人员、产前影像学专家及产前咨询医师。当应用WES或panel测序时，由于检测范围的局限，无法对染色体的拷贝数变异进行分析，虽然WGS用于检测拷贝数变异和结构重排更为可靠，但价格相对昂贵，序列分析的复杂性也很大。因此，如果产前影像学检查发现的胎儿表型不能高度指向某一单基因病，则仍应遵循现有指南，以CMA技术（或与CMA技术具有同等检测能力的拷贝数变异检测方法）作为结构异常胎儿的一线检测方法。
三、科研和临床应用测序检测时需考虑的关键点
（一）声明内容
对胎儿进行测序检测时，最佳的方案是“一家三口”（即父母亲及胎儿）同时检测（即trio模式）。如仅为先证者测序，则需进行亲本来源的验证。
由于超声影像学技术的局限性及对胎儿期表型的认识不足，目前关于胎儿的基因型‐表型关系的知识有限，因此，对于胎儿的测序诊断，是使用针对某种表型的panel测序，还是WGS，尚无定论；儿童和成人的检测指南中对于变异的解释，也不确定是否可应用于胎儿。
提供产前测序诊断时，进行检测前咨询、签署知情同意书、结果解释及检测后咨询的人员，必需熟知其中的利弊。进行结果解读和咨询前，最好先通过多学科讨论，多学科团队成员应包括临床和实验室人员，并结合临床记录、测序结果和胎儿影像学资料综合分析。
全面的检测前咨询、充分的知情同意及全面的检测后咨询非常必要，进行胎儿测序诊断需要得到胎儿父母双方的同意，咨询者需向夫妇双方提供个体化的检测前咨询，以通俗的语言解释相关的遗传学知识。如果进行trio模式测序，还需分别获得夫妇双方的知情同意书。检测前咨询和知情同意书需包括检测结果的类型（致病性、可能致病性、不能确定意义、可能是良性和良性的变异）、结果是否包括意外发现（如与胎儿表型无关的儿童期发病的疾病）、次要发现（如恶性肿瘤易感基因）及成年期发病的相关基因、报告周期、检测的风险（如检测失败或可能在分娩之前不能获得胎儿的结果）。检测前咨询还应涉及检测结果的时效性，即报告内容仅基于报告发放当时的知识，随着时间的推移，对疾病相关基因的知识、序列变异的致病性及胎儿表型的认识上都可能发生变化。样本储存和（或）数据存储方案、数据再分析相关的信息以及数据共享的方案也应在检测前咨询中涉及。检测后咨询和结果返回的情况（如报告了哪些结果），应根据检测前咨询时医患双方讨论的结果而定。建议对所有测序者都进行检测后咨询，包括检测结果阴性者。
（二）解读
- 检测方案的选择：测序技术在儿童罕见病中应用的经验告诉我们，当使用trio模式进行WES检测时，总体检出率可达40%（WGS的检出率约为42%），相对于仅检测先证者的模式（检出率为28%）大大提高。在产前诊断中，如何缩短报告的周期是测序技术实际应用的重要考量之一。
trio模式分析胎儿及生物学父母的样本，可过滤家族性良性变异，一方面使仅出现在胎儿中的新发突变易于识别；另一方面通过遗传方式的分析，可使隐性疾病或基因印迹异常的疾病同时确定，而无需如先证者模式分析中对可疑突变逐个进行验证。因此，相对于先证者模式，trio模式的变异分析数仅为⅒，在提高检测能力的同时，大大减少了分析量。
- 偶然发现和次要发现：偶然发现是指，可能具有临床重要性，但与本次检测目的无关的结果，如与儿童期发病相关的突变、一家三口的亲缘关系等。次要发现是指，与临床检测指征无关但具有临床可操作性的突变，美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）对这类基因突变进行了规定，目前定义了59种基因的已知和可能的致病变异。无论是WES还是WGS，相比特定基因检测，在提高检出率的同时，还增加了检出偶然发现和次要发现的可能。尽管对于出生后的WES，ACMG建议临床实验室积极寻找和报告59种基因的已知和可能的致病变异，但产前检测时是否需要报告尚无一致意见，联合声明也仅提出应在检测前咨询中告知是否报告。儿科专业的指南认为，除非目前能受益，否则这些预测性的结果应在儿童成长到具有足够决定能力时再告知。而最近的美国人类遗传学会（American Society of Human Genetics，ASHG）认为，应根据具体情况决定是否对预测性结果提前告知。由于产前检测结果可能影响是否继续妊娠的决策，因此对妊娠伦理具有重要挑战。
四、应用指征
（一）声明内容
无论是在研究还是临床应用领域，测序技术发展迅猛，但对胎儿的诊断性测序仍缺乏大样本量的研究和足够的证据，早期的经验为实验室和临床应用胎儿诊断性测序提供了以下建议：
尽管经验有限，但在以下情况对胎儿进行测序可能获得更大的益处：（1）胎儿有1个或多个器官异常，提示可能为遗传性疾病，但CMA检测未明确诊断；或在没有CMA结果的情况下，经多学科讨论高度怀疑胎儿为单基因病。（2）双亲中任何一位曾有过不良妊娠史（胎儿1个或多个器官异常），此次妊娠的胎儿与前次的表型类似，但CMA检测未明确诊断者。此种情况下，夫妇双方妊娠前来咨询时，由于胎儿样本无法获得，可对夫妇双方进行测序，以寻找同一基因的突变携带情况，发现与胎儿相关的常染色体隐性疾病。当然，尽可能获得先证者或异常胎儿的样本是最优选择，这类情况也包括原因不明的反复死胎。目前没有证据支持将测序常规用于除胎儿超声结构异常以外的情况。
（二）解读
通常通过比对人群频率、基因‐表型的相关性、遗传方式及突变类型等方案的综合应用，来筛选具有临床重要性的基因变异。然而，由于胎儿表型的不完全性及疾病表型表现的时间问题，基因‐表型相关性筛选方案在产前诊断中具有一定的困难。因此，变异筛选的准确性和全面性会受到影响。现有的产前诊断测序研究发现，对于胎儿孤立性颈部透明层增厚和没有进行表型筛选的结构异常的胎儿，测序的总体检出率最低，分别为7.7%、6.2%，而多发畸形的诊断率为14.3%16.0%；对于进行表型筛选的家系，其诊断率可达到80%。因此，具有指向性的特征性表型、多发畸形及具有家系复发性者，均为产前测序分析的适应证。这些指征应随着产前测序应用的不断发展而不断调整。
五、测序结果分析和咨询
（一）声明内容
尽管证据仍然有限，但早期经验仍支持诊断实验室或研究机构采纳以下质量标准、变异解释和报告发放的建议：
应遵循其他临床诊断测序的实验室质量标准、分析和变异注释原则。与所有的诊断检测一样，这应仅在获得产前WGS检测认可和有相关的解释经验的诊断实验室中进行。
关于表型的临床信息是测序数据解释的组成部分。在检测之前，临床信息必须由临床医师以标准化格式提交，推荐使用人类表型术语。此外，临床医师应提供影像学资料（至少报告且最好通过相关图像补充）。鼓励实验室建立系统以便于提交标准化表型信息，并将其作为检测申请过程的一部分。
初始的变异注释和分类最好由诊断实验室进行，而致病性和临床意义应结合胎儿表型和其他临床信息进行综合评估。评估最好通过上述的多学科讨论。
鉴于测序数据的复杂性，应加强实验室人员与临床医师的交流，并在临床专家的指导下形成最终报告或对解释进行修改。
对胎儿样本的测序结果报告，最好关注与胎儿表型相关的病理性变异或可能的病理性变异。
一些实验室可能会报告与胎儿表型相关的候选疾病基因中意义不明的变异，例如，与胎儿表型可能相关的常染色体隐性基因，检出1 个致病突变（或可能致病）和1 个意义不明的突变，分别遗传自双亲。这种情况应在检测前咨询中说明，且进行专业的检测后咨询。
有些实验室会报告中度至重度儿童期发病和成年期发病的疾病相关的致病基因和可能致病的变异。这种情况应在检测前咨询中说明，并且由遗传咨询专业和儿科专业的人员进行检测后咨询。
当进行一家三口测序时，实验室可能会报告其他临床上重要的发现，例如夫妇双方严重疾病致病位点的携带者状态，这可能对本次妊娠检测或再次妊娠产生影响。在检测前咨询和知情同意过程中，应解决夫妇双方样本结果报告的策略。
建议对所有未获得阳性诊断报告的结果进行回顾，包括以前的胎儿、婴儿和其他家系成员等可能与再次妊娠的胎儿相关的测序数据。如果有可能，应在计划妊娠或已经妊娠时，对数据进行再分析（要先获得知情同意）。
结果解读时应涉及关于胎儿父母双方未来生殖和检测的方案。
建议以通俗的语言向胎儿父母提供书面的咨询意见，包括检测结果、遗传咨询及生殖选择等信息。
（二）解读
通常，通过比对人群变异频率、表型‐基因相关性分析、遗传方式分析、突变类型分析等多种方案的综合应用对基因变异进行筛选。而表型‐基因相关性分析，在很大程度上决定了具有临床重要性的的候选基因，精确的表型描述也有利于更快速、准确地锁定目标基因突变，缩短报告周期；因此，标准化格式的临床信息是实验室分析的关键性内容。加强实验室与临床的沟通，不但可以帮助实验室尽快获得检测报告，还有助于临床咨询师进行结果咨询时可对结果充分认知。而检测后结果的报告和咨询，均应按检测前咨询时达成的相关内容进行报告和咨询。
